免疫共沉淀(Co-lmmunoprecipitation)是使用抗原与抗体之间的专一性作用为基础,从而用于研究尊龙凯时质与尊龙凯时质之间相互作用的一种要领。。。。浚浚浚抗体与裂解液中响应的尊龙凯时连系后,再与ProteinA/G偶联的Sepharose或MagneticBeads孵育,通过离心或者借助磁力架获得ProteinA/G磁珠-抗体-目的尊龙凯时复合物,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,网络上清,上清中包括抗体、目的尊龙凯时和少量的杂尊龙凯时,再通过Western Blot或质谱(MS)判断尊龙凯时质。。。。其原理图如下:

Q1：通过CoIP后WB验证发明
，，，，没有想要的目的条带？？？？

A：多方面缘故原由造成:

1）有可能是样品被尊龙凯时酶降解
，，，，对应的策略是需要添加尊龙凯时酶抑制剂
，，，，所有操作坚持4℃以下冰上操作且阻止重复冻融。。。。

2）有可能是抗体浓度太低导致条带较浅
，，，，则需要调解IP或WB抗体浓度
，，，，须要时设立浓度梯度
，，，，探索最佳浓度。。。。

3）抗体亲和力太低
，，，，选用适合于IP或者WB的抗体。。。。

4）有的IP抗体未与磁珠连系
，，，，这种情形需选用适合IP的磁珠。。。。

5）若Tag未袒露在融合尊龙凯时构象的批注
，，，，则需改变Tag融合表达部位。。。。

6）裂解液盐碱度太高
，，，，需用低盐碱度的裂解液。。。。

7）抗体选择不当
，，，，替换抗体。。。。

Q2：通过CoIP后WB验证发明
，，，，虽然可见目的条带
，，，，可是配景很高：

A：多方面缘故原由造成:

1）由非特异带白连系导致配景高
，，，，若要避色主特异性带白连系
，，，，则需要在无血清溶液中裂解细胞
，，，，且在免疫沉淀前用protein(A/G)磁珠预洗免疫沉淀后增添漂洗次数和盐碱度(高盐或去垢剂)。。。。

2）实验仪器或试剂被污染
，，，，使用清洁的仪器及现实。。。。

3）转移膜上的目特异吸附导致配景高
，，，，实验操作历程中载手套
，，，，使用镊子来取
，，，，不要接触膜转移面。。。。

4）制备样品中可能有不完全溶释的大的尊龙凯时复合体
，，，，则在制备样品后举行知暂超声处置惩罚(3次
，，，，每次5秒钟 )
，，，，然后离心
，，，，取上清后举行后续试验。。。。

5）洗涤不彻底
，，，，则需要多次洗涤
，，，，并设新增添洗涤液中的NaCl和去垢剂浓度。。。。

6）可能有非特异性尊龙凯时吸附于珠子上
，，，，则须举行Preclearing以排非特异性吸付。。。。

7）抗体自己待异性欠好可能导数者景高
，，，，则须选择合适的抗体
，，，，可以思量单抗。。。。

8）使用了过多的细胞或组织举行裂解导致配景高
，，，，则须镌汰样本量
，，，，推荐100-500ug细胞裂解物。。。。

9）尊龙凯时降解也可能泛起高配景的情形
，，，，只管使用新鲜制备的样品。。。。

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